常见的致泻型大肠杆菌分为以下6种类型：肠致病性大肠杆菌(EPEC)、产肠毒生性大肠杆菌(ETEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、弥漫黏附性大肠杆菌(DAEC)和肠聚会性大肠杆菌(EAEC)[1]。其中EAEC可通过粪口授播引起炎症性泻肚，以特等的“聚会样”或“砖堆样”的形式黏附于上皮细胞株HEp-2[2-3]。EAEC多引起发展中国度和工业化国度断奶幼儿和旅行者的急性或捏续性泻肚和溶血性尿毒症，而常见的滋活泼物如鸡、猪、牛、羊亦然其迫切宿主，其中牛的带菌率可高达16%[4]。环境中残留的细菌对当代滋生企业的效益产生迫切影响，企业多使用化学制剂通过熏蒸或喷洒的形式对环境进行消毒，如过硫酸氢钾、戊二醛和二氧化氯等在线ａｖ，但这些消毒剂在使用历程中产生的药物残留会对使命主说念主员的健康变成一定伤害，或被迫物误吸误食之后对动物的健康变成要挟[5-6]。
1921年，Bruynoghe和Maisin初次将噬菌体应用于葡萄球菌感染的诊疗[7]，而后，由于噬菌体在当然界的丰采偏执较好的宿主特异性，超越是噬菌体在杀菌历程中的安全性以及对多重耐药菌的杀灭遵守，使噬菌体在“生物防治”方面具有较大的发展后劲。
本考研对实验室保存的2株EAEC噬菌体PNJ180911、PNJ180913进行生物学特色分析，商量其对宿主菌CVCC232生物被膜的裂解遵守，并探索了噬菌体在模拟密闭空间、滋生温度、粪便pH和阳光直射等环境中对宿主菌的杀灭遵守，为研制新式杀菌剂奠定了基础，对EAEC的防控具有迫切有趣。
1 材料和要领 1.1 培养基与试剂琼脂粉、胰卵白胨、酵母索取物、氯化钠、HCl、NaOH、甲醇、冰醋酸、草酸结晶紫、SM缓冲液(NaCl，5.5 g；MgSO4·7H2O，2 g；1 mol/L pH 7.5 Tris-HCl，50 mL；明胶，0.1 g，ddH2O定容至1000 mL)。
1.2 菌株与培养条目肠聚会性大肠杆菌CVCC232购自中国兽药监察所菌种收藏中心，分离自上海某猪场泻肚仔猪。大肠杆菌在液体Luria-Bertain(LB)培养基或固体LB平板上培养。噬菌体PNJ180911、PNJ180913均由本实验室分离并保存。
1.3 噬菌体形态的不雅察将10 μL噬菌体悬液滴于铜网上，静置10 min，用滤纸吸去边际过剩的液体，滴加10 μL 2%磷钨酸，复染2 min，当然风干后，用透射电镜(TEM)不雅察噬菌体的形态。
1.4 噬菌体宿主谱的测定用平板点样法测定噬菌体的宿主谱，登科本实验室保存的167株不同动物源的大肠杆菌测定2株噬菌体的宿主谱，不雅察平板上噬菌斑的形成情况。
1.5 噬菌体最好感染复数(MOI)的测定将CVCC232培养至对数期，浓度为1× 108 CFU/mL。按照感染复数为0.001、0.01、0.1、1、10和100的比例别离将噬菌体与细菌等量搀杂，静置15 min，10000 r/min离心10 min，弃上清，千里淀用5 mL液体LB重悬，37 ℃摇床培养5 h后10000 r/min离心10 min，取上清液，双层琼脂平板法测效价，以产生最高效价的比例为最好感染复数。
1.6 噬菌体一步助长弧线的测定将噬菌体与宿主菌CVCC232以最好感染复数均匀搀杂，37 ℃静置15 min，10000 r/min离心10 min，弃上清，将千里淀用37 ℃预热的5 mL液体LB重悬，取200 μL，12000 r/min离心30 s，取上清测效价，以此时候计为零时，置于37 ℃摇床培养，前20 min每5 min取样测效价，20 min后每10 min取样并测效价，共捏续120 min。
1.7 噬菌体对pH和温度的耐受性检测噬菌体对pH的耐受性检测：用HCl、NaOH溶液将SM缓冲液出动至pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，以不同pH的SM缓冲液稀释噬菌体，37 ℃水浴锅温育，别离于0.5 h、1 h后取样，双层琼脂平板法测定其效价。
噬菌体对温度的耐受性检测：将噬菌体别离搁置于40、50、60、70、80 ℃水浴锅中温育，别离于0.5、1 h后取样，双层琼脂平板法测效价。
1.8 噬菌体体外杀菌遵守的测定将簇新菌液(1×108 CFU/mL)与噬菌体别离以MOI=0.1、1、10、100的比例均匀搀杂后加入96孔板中，阳性对照孔加入200 μL浓度为1×107 CFU/mL的菌液，设3个复孔。将96孔板置于酶标仪中37 ℃悠扬培养，每小时测量OD600处的吸光值，共测量16 h。
1.9 模拟滋生环境中噬菌体制剂的杀菌遵守 1.9.1 模拟闭塞安装中噬菌体制剂的杀菌遵守:在已灭菌的透明密封箱底部搁置几许无盖的固体LB平板，使用无菌喷壶将5 mL CVCC232 (5× 105 CFU/mL)均匀喷洒在箱子里面，室温静置，使细菌当然千里降到箱子底部(图 1)。
将噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13和噬菌体鸡尾酒经雾化和喷雾经管后，测定其对宿主菌的杀灭遵守。
(1) 雾化法：将30 mL噬菌体悬液(109 PFU/mL)装至超声雾化器中，流畅箱体，使噬菌体雾化液充满通盘箱体。
(2) 喷雾法：将5 mL噬菌体悬液装入喷壶中，均匀喷洒至箱体。
雾化或喷雾竣事后，别离于30 min、1 h、2 h后各取出3块平板，极端，37 ℃孵育14 h，对照组使用无菌SM缓冲液雾化或喷雾，然后进行菌落计数。
1.9.2 噬菌体喷雾对大地的杀菌遵守:使用切割后的水泥地板(15 cm×15 cm)模拟水泥大地。使用喷壶喷洒2.5 mL菌液(5×105 CFU/mL)至水泥板十足浸湿，10 min后喷洒等量的噬菌体或者SM液，2 h后用无菌脱脂棉球蘸取PBS缓冲液擦抹水泥板，然后将棉球浸入5 mL PBS中，4 ℃静置24 h在线ａｖ，平板计数法测菌落数。
1.9.3 噬菌体喷雾对粪便的杀菌遵守:将20 g高压灭菌后的猪粪与10 mL CVCC232均匀搀杂后倒入无菌平皿(直径90 mm、高12 mm)中，使其充满通盘平皿，24 h后喷洒5.0 mL噬菌体制剂，逐日2次，共喷洒2 d，对照组喷洒SM缓冲液。终末一次喷洒2 h后，分一名取名义和距名义0.5 cm处的粪便各1 g，别离加入5 mL PBS，平板计数法测菌落数。
1.10 噬菌体对细菌生物被膜的裂解作用参考欧阳凤菊的要领[8]，采选微孔板法对CVCC232生物被膜形成才略进行检测，判定CVCC232形成被膜的最好时长。在96微孔板中培养降生物被膜态的细菌，弃培养液，每孔加入200 μL噬菌体悬液，对照组加入等量SM缓冲液，37 ℃培养，24 h后不雅察被膜裂解情况。
1.11 噬菌体在滋生环境中的耐受性测定 1.11.1 滋生温度对噬菌体活性的影响:某鸡场全年测温数据流露，鸡场内最高温度不逾越30 ℃，动物俯卧休息的地点与体温周边，约为37 ℃，而滋生场的温度一般适度在26 ℃[9-10]。本考研探索了26 ℃和37 ℃条目下噬菌体效价在7 d内的变化。将噬菌体悬浮液别离放入26 ℃和37 ℃恒温培养箱内连气儿培养7 d，每天于交流本领点取样测效价。
1.11.2 粪便pH对噬菌体活性的影响:畜禽粪便的pH畛域是6.0-8.5[11-12]，故将噬菌体悬液pH别离调为6.0和8.5，置于4 ℃，于每天交流本领点取样测效价，共测量7 d。
1.11.3 阳光直射对噬菌体活性的影响:噬菌体算作环境杀菌剂在白日神用时，阳光中紫外线可影响噬菌体的活性。本考研平直采选阳光照耀的要领测定其对噬菌体效价的影响。将噬菌体装入透明试管内置于阳光下照耀6 h，每2 h测一次效价。
1.12 宿主菌抗性突变率的检测将CVCC232培养至对数期，以最好感染复数将噬菌体和菌液搀杂，用平板计数法检测该体系中CVCC232的原始菌落数，37 ℃摇床培养5 h至表示(此时即认定统共非抗性菌株已被噬菌体裂解)，8000 r/min、10 min离心搀杂液，弃上清，千里淀用PBS重悬，用平板计数法测定抗性菌落数。菌株的抗性突变率=抗性菌落数/原始菌落数[13]。
1.13 数据及分析本商量中统共实验数据均为3个幽闲重叠实验的平均值±步调偏差(mean±SD)。采选GraphPad Prism version 5.0软件进行数据分析和图表制作。
2 闭幕和分析 2.1 噬菌体的形态噬菌体PNJ1809-11在双层琼脂板上形成的噬菌斑直径约为3 mm，有晕环，噬菌斑边际透亮、整皆(图 2-A)；PNJ1809-13在双层琼脂平板上形成的噬菌斑直径约为1 mm，无晕环，噬菌斑边际透亮、整皆(图 2-B)。
透射电镜下噬菌体PNJ1809-11头部呈狭长的六面体，直径约118 nm×73 nm，有一个可伸缩的尾部，长约103 nm，并可见伸展的尾丝(图 2-C)；PNJ1809-13头部呈六面体，直径约113 nm×65 nm，有一个可减弱的尾部，长约104 nm，并可见伸展的尾丝，两株噬菌体均为肌尾病毒科噬菌体(图 2-D)。
2.2 噬菌体的裂解谱噬菌体裂解谱测定闭幕流露，PNJ1809-11可裂解155株大肠杆菌，裂解率为92.82%；PNJ1809- 13不错裂解46株大肠杆菌，裂解率为27.54% (附表 1)。
2.3 最好感染复数(MOI)当噬菌体与宿主菌浓度比为10︰1时，噬菌体PNJ1809-11和PNJ1809-13均开释出最多子代颗粒，效价别离为2.1×109 PFU/mL和1.8×109 PFU/mL，因此噬菌体PNJ1809-11和PNJ1809-13的最好感染复数(MOI)均为10 (表 1)。
2.4 一步助长弧线一步助长弧线闭幕流露，噬菌体PNJ1809-11的隐没期为15 min，15 min后干预爆发期，其效价在15-80 min马上加多，并于80 min达到峰值，保管在7.0×108 PFU/mL不再显著篡改，裂解量为52。噬菌体PNJ1809-13的隐没期为15 min，15 min后干预爆发期，其效价在15-50 min马上加多，并于50 min达到峰值，保管在2.8×108 PFU/mL不再显著篡改，裂解量为21 (图 3)。
2.5 pH耐受性pH耐受性检测流露，噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13在pH 3-11畛域内皆可存活，在pH≤2或pH≥12时，其活性十足丧失，最适pH为7 (图 4)。
2.6 热通晓性热通晓性检测闭幕流露，噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13在40 ℃时活性均保捏通晓，60 ℃作用30 min后活性显赫裁减，作用1h则十足失活；噬菌体PNJ1809-11在70 ℃作用30 min仍有一定活性，PNJ1809-13在70 ℃条目下作用30 min则十足失活。80 ℃考研组2株噬菌体均不耐受，在30 min十足失活(图 5)。
2.7 噬菌体体外抑菌遵守体外杀菌遵守流露，当MOI=1时，噬菌体PNJ1809-11在前3 h显赫遏止宿主菌的助长，当MOI=10和MOI=100时，PNJ1809-11遏止CVCC232助长的时候延迟至5 h，OD600处的吸光值可低达0.09，由图可知，当MOI=10时，PNJ1809-11的体外抑菌遵守最为显赫(图 6-A)。当MOI=10时，噬菌体PNJ1809-13在前3 h显赫遏止宿主菌的助长，当MOI=100时，PNJ1809-13遏止CVCC2323助长的时候延迟至5 h，而当MOI=0.1和MOI=1时，噬菌体对CVCC232的助长则十足莫得遏止作用(图 6-B)。
2.8 模拟闭塞安装中噬菌体制剂对细菌的杀灭遵守 2.8.1 经雾化、喷雾经管后噬菌体制剂对宿主菌的杀灭遵守:经雾化经管后噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13及噬菌体鸡尾酒对宿主菌CVCC232的杀菌遵守均可达到99%以上，其中PNJ1809-11的杀菌遵守稍强于PNJ1809-13，而噬菌体鸡尾酒的杀菌遵守则介于二者之间；经喷雾经管后噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13偏执搀杂制剂的杀菌遵守均可达99%以上，与雾化组杀菌遵守无显赫相反，但喷雾经管只需5 mL噬菌体悬液，因而后续考研礼聘喷雾经管形式进行杀菌遵守评价(表 2，表 3)。
2.8.2 噬菌体喷雾对大地的杀菌遵守:喷雾经管的噬菌体对大地细菌的杀灭遵守流露，与对照组比较，噬菌体PNJ1809-11对大地宿主菌经管后，残留菌落数下落了约2.5个数目级，杀灭遵守为99.32%；噬菌体PNJ1809-13经管后，菌落数下落了约1个数目级，杀灭遵守为91.23%；噬菌体鸡尾酒的杀菌遵守为95.39%，杀菌遵守介于两者之间(表 4)。
2.8.3 噬菌体喷雾对粪便的杀菌遵守:与空缺对照比较，噬菌体单独经管组与鸡尾酒组对粪便名义细菌的杀灭遵守均达到99.50%以上，杀菌遵守按序为：鸡尾酒 > PNJ1809-11 > PNJ1809-13；而三组噬菌体制剂对粪便里面宿主菌的杀灭率均低于15.00%，杀灭遵守按序为：鸡尾酒 > PNJ1809-11 > PNJ1809-13 (表 4)，标明喷雾经管的噬菌体对粪便名义细菌的杀灭遵守显赫强于对里面细菌的杀灭遵守。
2.9 噬菌体制剂对大肠杆菌CVCC232生物被膜的裂解CVCC232形成的生物被膜量在36 h时最高，此时OD/ODc=3.02，被膜形成能为中等阳性(表 5)。显微镜下不雅察CVCC232在细胞爬片上助长36 h后形成的被膜形态，可见有大批微菌落连成片状(图 7-A)。
与对照组比较，噬菌体PNJ1809-11经管组和噬菌体鸡尾酒经管组孔内的液体显著变清，标明噬菌体PNJ1809-11和噬菌体鸡尾酒可灵验裂解CVCC232形成的生物被膜(图 7-B)。经固定染色后测量各孔OD600处的吸光值，噬菌体PNJ1809-13考研组对CVCC232生物被膜的裂解遵守为78%；PNJ1809-13的裂解遵守为30%；噬菌体鸡尾酒的裂解遵守为83%，为考研组中裂解遵守最高的一组(表 6)。
2.10 噬菌体在滋生环境中的耐受性 2.10.1 噬菌体在滋生温度下的耐受性:PNJ1809-11在26 ℃和37 ℃下活性变化较小，1周后效价均下落了约1个数目级，但37 ℃条目下活性变化稍大(图 8-A)；而在26 ℃条目下，噬菌体PNJ1809-13在7 d内效价裁减了约1个数目级，37 ℃条目下则裁减了近2个数目级，标明噬菌体PNJ1809-11在滋生温度下耐受性更强(图 8-B)。
2.10.2 噬菌体在粪便pH中的耐受性:噬菌体PNJ1809-11的效价在0-4 d内在pH 6.0和pH 8.6的条目下均较通晓，5 d后效价入手冉冉下落，最终效价变化不逾越1个数目级(图 8-C)；噬菌体PNJ1809-13的效价在pH 6.0条目下于第2天和第4天显著裁减，在pH 8.5条目下简略下落，对pH 6.0弱酸条目下稍敏锐(图 8-D)。
2.10.3 阳光直射对噬菌体活性的影响:经阳光照耀6 h后，2株噬菌体的效价均有不同进度的下落，PNJ1809-11的滴度由开动的1.6×109 PFU/mL降至2.8×108 PFU/mL，约下落6倍；PNJ1809-13的滴度则由开动的4.8×108 PFU/mL降至4.5×107 PFU/mL，约下落1个数目级。噬菌体PNJ1809-11联系于PNJ1809-13在阳光照耀下较通晓(图 8-E)。
2.11 宿主菌对噬菌体的抗性突变率经检测CVCC232对噬菌体PNJ1809-11产生抗性菌株的概率为2.5×10-3，对PNJ1809-13产生抗性菌株的概率为1.0×10-3(表 7)。
3 商量本商量评估了2株噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13以单一状貌和鸡尾酒状貌别离经喷雾和雾化经管后对密闭箱中的细菌的杀灭遵守。考研闭幕流露，无论是雾化组已经喷雾组，在噬菌体PNJ1809-11、PNJ1809-13和噬菌体鸡尾酒3组考研中，噬菌体PNJ1809-11的杀菌遵守最好；与雾化经管比较，在相同杀菌率的条目下，喷雾经管组所需的噬菌体量是雾化经管组的1/6，若应用于滋生环境中，出于资本的斟酌，喷雾经管的形式具有一定的上风。不同微生物对雾化的耐受力也不同，雾化器经管历程中，超声波也会裁减噬菌体的存活量，雾化时候、雾化量等要素也会影响噬菌体的雾化遵守，超声雾化后噬菌体的生物安全性也需要进一步考量；而喷雾经管操作好像浮浅，噬菌体用量少，因而后续使用喷雾化噬菌体作用于模拟滋生环境探讨噬菌体对大地、粪便的杀菌遵守。喷雾经管的噬菌体对大地、粪便名义均有较好的杀灭遵守，其中鸡尾酒的灭菌遵守最好，其次为噬菌体PNJ1809-11、遵守最差的为PNJ1809-13，但喷雾经管的噬菌体对粪便里面细菌的杀灭遵守并不睬思。实验滋生场中粪便名义及里面中均有细菌定殖，不管是噬菌体喷雾已经其他化学喷雾剂，在对粪便进行消毒灭菌时主要对粪便名义的细菌起灭活作用，提倡滋生场进行消毒前先撤废粪便、饲料、垫料、有机物和秽物等，作念好消毒前准备。
生物被膜是细菌黏附的共同体，将细菌包裹在内使细菌比浮游景况具有更高的代谢才略，保护细菌免受免疫细胞的错误，更是细菌产生抗性、难以被消毒剂杀灭的原因[14]。抗生素只可撤废浮游态细菌却弗成撤废讳饰在生物被膜内的细菌[15]。细菌可在饲槽、笼架等名义形成生物被膜，这就要求滋生场的消毒剂具有撤废生物被膜的才略。关系文件标明噬菌体、噬菌体裂解酶都可撤废细菌名义的生物被膜[14]。本考研闭幕流露，宿主菌CVCC232形成的生物被膜在用噬菌体悬浮液作用24 h后可被显赫碎裂，但2株噬菌体对生物被膜的撤废才略有显赫相反：噬菌体PNJ1809-13单独作用于被膜时撤废率很低，而PNJ1809-11对生物被膜的撤废遵守显赫优于PNJ1809-13；然而，将两株噬菌体以鸡尾酒的状貌作用于生物被膜后，对被膜的裂解遵守要好于苟且一株。该考研闭幕标明本实验室分离的两株噬菌体不仅能灵验杀灭环境中的细菌，还可撤废滋生环境中宿主菌形成的生物被膜，且噬菌体鸡尾酒的遵守最好。异日可斟酌将噬菌体鸡尾酒足下于肉品、案板和医疗器械等生物被膜的撤废，若与抗生素、钴离子和氯等物资联用遵守可能会更好。
伦理片在线观看影院麒麟喷雾经管的噬菌体在模拟滋生环境的温度、粪便酸碱度、阳光直射下的活性变化考研中，PNJ1809-11对这些环境条目的耐受性更强，算作生物消毒剂具有更大上风，有望将其建树成新式环保、高效的生物消毒剂，这对滋生场的环境净化及大肠杆菌的防控具有迫切有趣。但由于考研条目限制，本考研仅使用密闭箱、水泥板和东说念主工浑浊粪便等模拟滋生环境，未能在滋生场现场检测噬菌体的杀菌遵守，且滋生场中的菌种更为复杂，若后续将噬菌体应用于临床，需分离更多的噬菌体，将具有不同裂解谱的噬菌体以鸡尾酒的状貌喷洒于滋生环境，进一步探索噬菌体算作环境消毒剂的可能。
噬菌体与细菌共进化历程中会产生噬菌体抗性菌株。细菌可通过阻断噬菌体的吸附、遏止噬菌体DNA的打针、讳饰噬菌体DNA的复制、CRISPR-Cas系统和流产感染等机制产生抗噬菌体突变株[16-17]。两种及以上具有不同裂解谱的噬菌体搀杂形成的制剂即为噬菌体鸡尾酒，使用噬菌体鸡尾酒不仅不错拓宽宿主谱，增强杀菌才略，还不错裁减噬菌体抗性菌株的产生概率[17-18]。在国际，噬菌体鸡尾酒或噬菌体制剂已被应用于肉类、生果、蔬菜中食源性细菌的杀灭[19]。好多动物实验和临床实验也标明噬菌体鸡尾酒制剂具有很是平素的裂解谱在线ａｖ，可灵验减少细菌的耐药性，且在动物模子上也有较好的保护力[20]。通过检测宿主菌CVCC232对2株噬菌体PNJ1809-11和PNJ1809-13抗性菌株的突变率，标明宿主菌产生抗噬菌体菌株的概率较大，还需分离更多的噬菌体，以噬菌体鸡尾酒的状貌克服这一问题。